Da li glifosat zamjenjuje glicin u bjelančevinama ćelija koje se aktivno dijele?

Original: https://people.csail.mit.edu/seneff/does_glyphosate_substitute.html

od Stephanie Seneff

[email protected]
18. avgusta 2019

Nedavno su članak objavili Antoniou et al. podebljanim naslovom, “Glifosat ne zamjenjuje glicin u proteinima aktivno podijeljenih ćelija sisavaca.” [1]. Rad je uključivao izlaganje ljudskih ćelija raka dojke glifosatu šest dana, a zatim korištenjem sofisticirane tehnike nazvane Tandem oznaka mase (TMT) označavanje za identifikaciju kratkih peptida koji navodno sadrže anomalno teške molekule glicina. Proteini iz tretiranih i netretiranih stanica provedeni su kroz standardni protokol koji uključuje spektrometriju mase, djelomičnu proteolizu i daljnju analizu, kako je detaljno opisano u radu.

Ćelije su održavane na bogatoj hranjivoj formulaciji koja se zove Dulbeccoov modificirani medij za orlove. Ova formulacija je modifikacija izvornog bazalnog srednjeg orla koji je četiri puta obogaćen aminokiselinama i vitaminima. Takođe ima visoku koncentraciju glukoze od 4500 mg/L. Ne postoji garancija da nije kontaminiran glifosatom. Nadalje, ćelije su u prošlosti uzgajane u kulturi neko neodređeno vrijeme i vjerojatno su akumulirale znatan broj pogrešno savijenih proteina kontaminiranih glifosatom koje je bilo teško očistiti. Vjerovatno su započeli svoj život u kulturi već s proteinima kontaminiranim glifosatom, kroz doživotno izlaganje glifosatu čovjeka koji je izvorno držao ove stanice u tumoru dojke.

Autori su testirali uzorke na dvije različite post-translacijske modifikacije (PTM): cistein modificiran glioksilatom i zamjenu glicina glifosatom. Uključili su modifikaciju glioksilata jer su pretpostavili da se glifosat može razgraditi na glioksilat, koji se može vezati za ostatke cisteina. Značajno je da nisu otkrili nikakve cisteine modifikovane glioksilatom ni u kontrolnim ćelijama ni u tretiranim ćelijama.

Nasuprot tome, autori su pronašli značajan signal prisutnosti glifosata u nekoliko kratkih peptida u tretiranim uzorcima. Međutim, također su pronašli jednako snažan signal u neobrađenim uzorcima. Napisali su: “Međutim, u ovom eksperimentu se ne očekuje da će se pojaviti bilo koji od dva navodno interesantna PTM-a (post-translacijske modifikacije) koji će biti prisutni u nedostatku tretmana glifosatom. Stoga je bilo moguće koristiti TMT označavanje za identifikaciju i filtriranje bilo kojeg potencijalnih lažnih otkrića.”

Jednako uvjerljiv argument je, međutim, da “neobrađene” ćelije također sadrže proteine supstituirane glifosatom. Potencijalno, većina ako ne i svi supstituirani peptidi kandidati su istinska otkrića. Budući da su i tretirane i kontrolne ćelije bile izložene glifosatu duži period u prošlosti, vjerovatno je da su obje akumulirale proteine kontaminirane glifosatom u gotovo jednakim količinama. Anthony Samsel i ja smo u svom prvom članku o zamjeni glifosata glicinom raspravljali o dokazima da N-supstituirani glicini mogu formirati peptoide koje je vrlo teško razgraditi, te da je pokazano da fosfonati imaju sposobnost inhibiranja proteolize [2].

Ideja da izloženost glifosatu rezultira akumulacijom proteina otpornih na proteolizu potkrijepljena je studijom objavljenom 2013. o biljkama graška [3]. Autori su primijetili nakupljanje ubikvitiniranih proteina zajedno s povećanom regulacijom enzima proteolize, što je iznenađujuće i neobično. Napisali su:

“Akumulacija ubikvitiniranih proteina, zajedno s povećanom navodnom aktivnošću proteasoma, primijećena je kroz ABPP [Profiliranje proteina zasnovano na aktivnosti], što ukazuje na ulogu proteasoma nakon tretiranja herbicidima. Akumulacija ubikvitiniranih proteina obično je opisana u vezi s istovremenim smanjenjem Unatoč tome, naši rezultati pokazali su porast i nivoa proteasomskog supstrata i aktivnosti. Stoga stres izazvan herbicidom na proteomu može rezultirati akumulacijom ubikvitiniranih proteina, uprkos povećanoj aktivnosti proteasoma ili povećanoj dostupnosti supstrata izazivaju aktivnost proteasoma.”

Vjerojatno objašnjenje je da glifosat ugrađen u proteine narušava sposobnost proteolitičkih enzima da ga razgrađuju. U stvari, u članku koji povezuje glifosat s amiotrofičnom lateralnom sklerozom (ALS) opisali smo kako glifosat može poremetiti sam proces sveprisutnosti, koji označava proteine za brisanje proteasomom [4]. Pisali smo:

“Najintrigantnija je činjenica da sam ubikvitin kritično ovisi o visoko očuvanom karboksi terminalnom paru dvostrukog glicina za izgradnju složenih ubikvitinskih lanaca koji signaliziraju protein za razgradnju [46] [reproducirano ovdje kao [5]]. Zamjena glifosata za bilo koji Za ove esencijalne glicine bi se očekivalo da naruše proces recikliranja pogrešno savijenih proteina. To bi lako moglo objasniti nakupljanje pogrešno savijenih proteina što je karakteristična značajka ALS-a.”

Na našu sreću, Antoniou i sur. [1] su u svojoj Tabeli 3 dali tačne sekvence sa zamjenama glifosata koje su otkrivene, a web stranica Uniprot pruža alat gdje se mogu pronaći proteini koji sadrže određene sekvence, koristeći programski paket pod nazivom BLAST. Uniprot je uspio pronaći identitet svih 15 proteina koji su predstavljeni kao pogoci na njihovoj slici 3, s tačnim podudaranjem sa sekvencom prisutnom unutar svakog proteina. Svih 15 proteina bili su ljudski proteini. Najmanje devet ovih proteina veže se za molekule koje sadrže fosfate, kako je nabrojano u Tabeli 1. Ovo daje podršku ideji da su proteini koji vežu fosfat posebno osjetljivi na supstituciju glifosata, kao što je artikulirano u nedavnom članku koji su objavili Gunatilake i sur. [6], predlažući da je glifosat glavni faktor u kroničnoj bubrežnoj bolesti nepoznate etiologije (CKDu) među poljoprivrednim radnicima u Šri Lanki. Zapravo, proteinska EPSP sintaza u biljkama za koju se vjeruje da je glavna meta glifosata u uništavanju korova sadrži visoko očuvan glicinski ostatak na mjestu gdje se veže fosfoenol piruvat (PEP). Istraživači iz DowDuponta uspjeli su koristiti CRISPR tehnologiju za stvaranje soja kukuruza otpornog na glifosat, zbog CRISPR-modificiranog gena za EPSP sintazu [7]. Prvi korak koji su učinili bio je promjena DNK koda tako da se glicin na mjestu vezivanja PEP zamijeni alaninom. To je rezultiralo verzijom enzima koja je bila potpuno neosjetljiva na glifosat.

Tablica 1: Devet proteina koji sadrže peptide supstituirane glifosatom, identificirano pomoću alata za spektrometriju Tandem oznaka mase (TMT). Ovi peptidi, zajedno sa još 6, pronađeni su u stanicama raka uzgojenim u kulturi. Svih devet se veže za molekule koje sadrže fosfat kako je naznačeno u trećoj koloni. Prva kolona daje otkriveni niz, gdje “*” označava glicinski ostatak za koji je utvrđeno da je supstituiran. Vidjeti: Antoniou i dr. (2019) za detalje o eksperimentalnom postavljanju.

Sve u svemu, Tablica 1 otkriva intrigantan popis ljudskih bjelančevina, a očekuje se da će se mnogi od njih eksprimirati u stanicama raka dojke. Na primjer, jedan je protein za metilaciju RNK (homolog tRNK(gvanin (10)-N2)-metiltransferaza). Drugi ima funkciju supresije tumora putem Akt inhibicije, vezanjem za fosfatidilinositol fosfate (član A porodice 5 koji sadrži domenu Pleckstrin homologije). Drugi je receptor vezan za G-protein (GPCR). Prema Bar-Shavit i suradnicima, “GPCR-ovi kontroliraju mnoge značajke tumorigeneze, uključujući funkcije posredovane imunskim stanicama, proliferaciju, invaziju i preživljavanje na sekundarnom mjestu.” [8] Još jedan hit je homeobox protein, a posebno se vjeruje da ova klasa proteina ima uzročnu ulogu u raku dojke [9].